ABSTRACT
Introduction Les vaccins à ARN messagers ont joué un rôle majeur dans la lutte contre la pandémie de SARS-CoV-2 grâce à une excellente efficacité et sécurité clinique. Ces vaccins ont été développés suite à des années de recherche fondamentale, dont l’une des étapes cruciales a été de remplacer l’uridine de l’ARNm par de la 1-méthyl-pseudo-uridine afin d’éviter la reconnaissance par les récepteurs de l’immunité innée, notamment le toll-like-receptor (TLR) 7. Une hypothèse, très fréquemment défendue mais jamais étayée expérimentalement, est que cet ARN modifié garde une activité immunostimulatrice à bas bruit permettant la production d’interféron de type I, agissant comme un adjuvant du vaccin. Les interférons de type I sont des cytokines antivirales essentielles et les patients ayant un déficit dans les voies de l’interféron de type I sont à haut risque de COVID-19 sévère. Dans ce travail, nous avons analysé la réponse lymphocytaire B au vaccin à ARNm de patients présentant l’absence de signalisation par les interférons de type I. Ceci nous a permis de savoir si les vaccins par ARNm permettaient d’établir une réponse lymphocytaire B robuste en l’absence d’interféron de type I. Patients et méthodes Nous avons constitué trois cohortes de patients (i) des patients avec des déficits génétiques sur les voies de l’interféron de type I : 2 patients avec une mutation homozygote d’IRF7 (facteur de transcription responsable de la production d’interférons de Type I, notamment en aval de TLR7) et un patient avec une déficit hémizygote de TLR7 (ii) des patients ayant des auto-anticorps neutralisant les interférons alpha et oméga, dans le cadre d’une polyendocrinopathie auto-immune de type I (APS-1, n = 14) (iii) des patients ayant des auto-anticorps neutralisant les interféron, associés à l’âge, une entité récemment décrite et particulièrement fréquente chez les sujets âgés (n = 8). Ces sujets ont été comparés à 29 contrôles sains. Tous étaient naïfs du COVID-19 et ont reçu 2 doses de vaccin à ARNm (BNT162n2 ou mRNA1273). Les patients ont été prélevés à différents point de temps, dans les 3 premiers mois et entre 3 et 7 mois après la seconde dose. La réponse sérologique a été évaluée par ELISA anti-IgG et IgA RBD (receptor binding domain de la Spike) et la neutralisation sérique a été testée in vitro contre le D614G-SARS-CoV-2. Les lymphocytes B (LB) mémoires CD19 + IgD-CD27± spécifiques du RBD ont été analysés en cytométrie en flux et triés en cellule unique pour séquençage des régions variables de la chaîne lourde de l’immunoglobuline. Résultats La réponse sérologique anti-RBD IgG et IgA était comparable aux temps précoces et tardifs de la réponse vaccinale, évoluant de façon similaire chez les patients déficients en interféron de type I et les sujets sains. La capacité de neutralisation des sérums contre le SARS-CoV-2 était également identique dans tous les groupes, et corrélait fortement avec le taux d’IgG anti-RBD, suggérant que le RBD était également la cible de la réponse neutralisante chez les patients déficients en interféron de type I. Des LB mémoires circulants spécifiques du RBD étaient retrouvés dans toutes les cohortes de patients déficients en interféron de type I au cours des 3 mois suivant la vaccination. Ceux-ci se maintenaient dans le temps et étaient encore présents entre 3 et 7 mois après la vaccination (0,18 % des LB IgD-CD27+ chez les sujets sains, 0,24 % chez les sujets avec déficit génétiques, 0,16 % chez les APS-1 et 0,26 % chez les AAB, pas de différence statistiquement significative). Le séquençage de la chaîne lourde des régions variables de l’immunoglobuline des LB mémoires spécifiques du RBD révélait l’accumulation progressive des mutations jusqu’à 7 mois chez les sujets sains, témoignant d’une réaction des centres germinatifs permettant la maturation d’affinité et la génération de lymphocytes B mémoires à longue durée de vie. Chez les patients IRF7 déficients, les LB mémoires spécifiques du RBD acquerraient progressivement des mutations de M1 à M6, et les LB mémoires spécifiques du RBD de patients TLR7 et APS-1 arboraient un nombre élevé de mutation dès M4, témoignant que même en l’absence de réponse à l’interféron de type I, le vaccin permettait la génération des LB mémoire issus des centres germinatifs, comme chez les sujets sains. Enfin, des clones partagés étaient retrouvés entre les sujets sains et les patients déficient en interféron de type I témoignant d’une réponse qualitativement normale. Conclusion Notre travail apporte des données rassurantes sur la vaccination de ces patients à haut risque de forme de grave de COVID-19 et suggère que l’ARNm contenu dans les vaccins n’a pas de rôle adjuvant intrinsèque.
ABSTRACT
Introduction La mémoire immunitaire est un mécanisme qui protège les individus contre la réinfection. Cette stratégie de défense de l’organisme, qui est à la base du succès des vaccins, comprend la production d’anticorps protecteurs dans le sang ainsi que la formation de cellules à mémoire, capables de se réactiver rapidement en cellules productrices d’anticorps lors d’une nouvelle infection. Les vaccins à ARNm, codant pour la protéine Spike du SARS-CoV-2, ont été rapidement déployés dans le monde entier, avec une grande efficacité clinique. Déterminer les caractéristiques de la réponse lymphocytaire B mémoire générée par ces vaccins est d’une importance majeure, notamment dans le contexte de circulation de variants du SARS-CoV-2, porteurs de mutations dans la protéine Spike. Nous avons étudié la dynamique, l’évolution clonale, et l’affinité des cellules B à mémoire chez des patients vaccinés par le vaccin à ARNm, ainsi que leur capacité à reconnaître et à neutraliser les variants du SARS-CoV-2 dans deux cohortes longitudinales de patients, l’une infectée lors de la première vague (convalescents-vaccinés), et l’autre n’ayant pas été infectée (naïfs-vaccinés). Patients et méthodes Les patients infectés lors de la première vague de la pandémie ont été inclus dans l’étude MEMO-CoV2. Une partie de ces patients avec une forme sévère hospitalisée, ou une forme modérée ambulatoire ont reçu une dose de vaccin à ANR messager (BNT162b2) un an après l’infection. De façon parallèle, une cohorte de soignants, naïfs de toute infection et avec une sérologie négative, ont été vaccinés avec deux doses de vaccin à ARNm. Ces deux cohortes ont été suivies et analysées (Sérologie, Cytométrie en flux des cellules B) longitudinalement jusqu’à 2 mois après le boost vaccinal (première injection pour les convalescents, deuxième injection pour les naïfs). Les cellules B mémoires spécifiques du domaine RBD de la protéine Spike ont été isolées, triées et cultivées en cellule unique. Pour chaque cellule anti-RBD mémoire, nous avons séquencé la chaîne lourde de l’immunoglobuline et nous avons déterminé l’affinité par Biolayer-interferometry des anticorps produits contre des variants préoccupants(α, β, γ et δ). Nous avons aussi déterminé pour certains clones leur capacité à neutraliser le virus D614G (dominant lors de la première vague) et β in vitro. Résultats La vaccination induisait une réponse sérologique IgG anti-RBD robuste chez tous les patients analysés (n=47). L’activité neutralisante du sérum contre le virus D614G était excellente pour tous les patients. Néanmoins, la neutralisation sérique des variants β et δ était très nettement meilleure chez les patients déjà infectés, suggérant que les plasmocytes mobilisés lors du boost vaccinal proviennent de cellules mémoires matures. L’analyse en cytométrie en flux, a mis en évidence une expansion du pool mémoires chez les patients convalescents à un niveau supérieur à celui des naïfs. L’analyse de plus de 2400 séquences de la chaîne lourde de l’immunoglobuline provenant de cellules B mémoires anti-RBD cultivés en cellule unique, a révélé que la réponse vaccinale anti-RBD mobilise des cellules peu mutées, donc nouvellement générées, chez les individus naïfs. À l’inverse les cellules mémoires mobilisées après le boost chez patients convalescents arboraient de nombreuses mutations somatiques, témoignant de la mobilisation de mémoires préexistantes. L’analyse du répertoire des cellules B mémoires montrait que sa diversité était conservée après la vaccination malgré son expansion. Nous avons ensuite analysé l’affinité de 382 anticorps monoclonaux issus cellules B mémoires mobilisées par le boost vaccinal, contre le RBD de différent variants (α, β, γ, δ, κ). L’affinité des anticorps contre la RBD sauvage était plus forte chez les convalescents que chez les naïfs et corrélait avec le nombre de mutations somatiques dans la chaine lourde de l’immunoglobuline, reflétant le processus de maturation d’affinité. Des clones de très haute affinité contre tous les RBD variants étaient détectés chez tous les individus testés, y compris chez les naïfs, ainsi que des clones neutralisant le variant β, qui a la plus grande capacité à échapper à la réponse immune. Conclusion Chez les patients convalescents, la vaccination amplifie un large répertoire de cellules B mémoires matures et génère des plasmocytes neutralisant les variants. Chez les individus naïfs, la vaccination induit un pool de mémoire contenant des clones neutralisants puissants contre tous les variants préoccupants actuels, dont bêta et delta. Nos résultats suggèrent qu’une troisième dose chez les sujets naïfs permettrait de différentier en plasmocytes les lymphocytes B mémoires de grande qualité générés par le schéma vaccinal initial et ainsi d’augmenter l’activité neutralisante des sérums contre les variants du SARS-CoV-2.
ABSTRACT
Un nouveau coronavirus émergeant, le SARS-CoV-2, est responsable d'une pandémie ayant entraîné plus de 2 millions de morts à ce jour. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent l'établissement d'une mémoire immunitaire contre ce virus est donc un enjeu crucial en terme de santé publique et de vaccination. Dans ce contexte, la caractérisation de la longévité et de la fonctionnalité de la réponse lymphocytaire B mémoire anti-SARS-CoV-2 est une question majeure, notamment pour évaluer la protection conférée par l'infection en cas de nouvelle exposition virale. Notre objectif était donc de caractériser la réponse lymphocytaire B mémoire après infection par le SARS-CoV-2. Nous avons suivi longitudinalement 2 cohortes de patients ayant eu une infection par le SARS-CoV-2 de gravité modérée (M-CoV, ambulatoires, n = 18) ou sévère (S-CoV, hospitalisés avec nécessité d'oxygénothérapie, n = 21), prélevés dans les semaines suivant le début des symptômes puis à 3 mois et 6 mois après l'infection. Notre stratégie expérimentale reposait sur 3 approches complémentaires : – l'étude couplée et en cellule unique du transcriptome, de la séquence des chaînes lourdes et légères des gènes d'immunoglobuline, de l'expression phénotypique de 20 marqueurs de surfaces et de la spécificité antigénique pour la protéine spike des lymphocytes B (LB) CD19 + IgD- de 4 patients S-CoV à M0 et M6 ;– la culture en cellule unique des LB spécifiques de la spike de ces mêmes patients dans un système permettant leur prolifération et leur différenciation en cellules sécrétrices d'anticorps afin d'obtenir la séquence de la chaîne lourde du gène d'immunoglobuline et la production de l'anticorps encodés par les LB pour tester leur réactivité en ELISA contre le domaine RBD de la protéine spike, contre la spike des coronavirus saisonniers HCoV-HKU1 et HCoV-OC43 ou bien de tester leur potentiel de neutralisation du SARS-CoV-2 in vitro ;– la validation de ces résultats sur l'ensemble de la cohorte en cytométrie de flux avec un panel permettant d'identifier les LB mémoires spécifiques de la spike. Nous avons pu mettre en évidence que la première vague précoce de plasmocytes (réaction extra-folliculaire) provenait essentiellement de la différentiation de lymphocytes B activés exprimant fortement le CD71. Ces plasmocytes étaient issus de LB naïfs mais aussi de LB mémoires préexistant et présentant une cross-réactivité avec la protéine spike des coronavirus saisonniers HCoV-OC43 et HCoV-HKU1. De façon synchrone, une réponse durable de type centre germinatif se mettait en place, permettant le développement d'un pool de LB mémoires spécifiques de la spike acquérant progressivement un phénotype de LB mémoire classique (CD19 + CD27 + IgD-CD71-). Ces lymphocytes B mémoires spécifiques persistaient jusqu'à 6 mois après l'infection, augmentant même chez les S-CoV et représentaient 1,95 % des LB mémoires circulants et 0,94 % chez les M-CoV (p = 0,004). Peu de ces cellules étaient en relation clonale avec les cellules ayant donné naissance à la vague plasmocytaire initiale. Les LB mémoires spécifiques de la spike présentaient une accumulation de mutations somatiques dans les gènes d'immunoglobuline avec le temps, caractéristique des cellules issues des centres germinatifs. Ces cellules comprenaient une part croissante de cellules reconnaissant le RBD entre M3 et M6, au détriment des cellules cross-réactives avec les coronavirus saisonniers : à 6 mois, 26,3 % des LB mémoires spécifiques de la spike reconnaissaient la région RBD de cette dernière, contre 11,1 % à M3. Un test de neutralisation in vitro a permis de confirmer que les anticorps encodés par ces LB mémoires spécifiques du RBD avaient une activité de neutralisation contre le SARS-CoV-2, dans 85 % des cas pour les S-CoV et 50 % pour les M-CoV. Notre travail met en évidence qu'une mémoire lymphocytaire B s'établit après infection par le SARS-CoV-2, et mature dans le centre germinatif pour cquérir des mutations somatiques. L'établissement de cette mémoire immunitaire capable de se réactiver et d'évoluer en cas de réinfection est une nouvelle encourageante dans la perspective vaccinale et l'apparition de nouveaux variants de la protéine RBD du SARS-CoV2. (French) [ABSTRACT FROM AUTHOR] Copyright of Revue de Médecine Interne is the property of Elsevier B.V. and its content may not be copied or emailed to multiple sites or posted to a listserv without the copyright holder's express written permission. However, users may print, download, or email articles for individual use. This abstract may be abridged. No warranty is given about the accuracy of the copy. Users should refer to the original published version of the material for the full abstract. (Copyright applies to all Abstracts.)